问答：深入了解 COVID-19 血清学 - The Native Antigen Company

来自 : 发布时间：2024-05-09

问答：深入了解 COVID-19 血清学

2020 年 7 月 8 日冠状病毒、COVID-19、免疫测定、研究

在当前冠状病毒大流行的过程中，我们都意识到了对核酸的迫切需求测试以识别目前感染 SARS-CoV-2 的人。所需的第二种测试形式是血清学免疫测定，c识别过去的感染，但发展起来更复杂。在此问答中，Andy Lane 博士讨论了适应性免疫以及用于开发用于 COVID-19 检测的免疫测定的抗原和抗体的产生。本文最初由 Clinical Laboratory Inc. 发表。

能否介绍一下该公司及其历史？

The Native Antigen Company 于 2010 年在英国牛津成立，开发天然病毒和细菌抗原以支持体外诊断行业的目标。继 2015/2016 年寨卡病毒流行期间成功开发试剂后，该公司经历了一段快速增长期，开始生产范围更广的天然和重组抗原，并为生命科学和生物技术行业提供定制和合同服务。快进到今年 2 月，公司成为首批被认可的 SARS-CoV-2 抗原供应商之一，此后开发了广泛且不断扩大的 ra一系列冠状病毒试剂以支持正在进行的研究和开发。

我们的试剂被广泛的传染病研究人员使用，但主要销往两个主要市场：体外诊断 (IVD)行业，他们使用抗原和抗体开发用于感染血清学诊断的免疫测定法，以及疫苗行业，他们使用抗原和抗体开发免疫测定法，以在临床试验中对动物和患者疫苗反应进行定性和量化。

您能否概述一下免疫是如何产生以应对感染的？

毋庸置疑，人体免疫系统非常复杂，但通常可以分为先天性和适应性免疫反应: 先天免疫是我们的第一道防线。它提供了一种快速但有些权宜之计的反应，主要是在传染性病原体以广泛的 ar 进入人体的那一刻起就试图杀死它们。非特异性细胞、蛋白质和生化物质的射线。在此过程中，先天反应会提醒适应性反应。适应性免疫代表免疫系统的精锐部队，它发起一种特别适合传染性病原体的攻击，使用更先进的武器来调解强大的下游反应。适应性反应的标志是克隆扩增，其中能够识别病原体的 B 和 T 淋巴细胞将被积极选择以快速建立它们的数量。一旦这些细胞达到显着水平，身体就能更好地检测和清除入侵的病原体，并倾向于形成对病原体的持久\"记忆”，以便更好地为未来的遭遇做好准备。

显示 T 细胞和 B 细胞激活和功能的适应性免疫简化图。

之后有些病毒感染后，我们再也不会感染它们，但在其他病毒感染之后，我们只能在短时间内受到保护——为什么会出现这种差异？

病毒再次感染有两个主要原因，即在感染后不久初始暴露。第一个是由于病毒变异的能力，这是通过自然acc发生的随着时间的推移遗传变化的累积（抗原漂移）或病毒基因组与相关毒株的重组，导致它迅速变异成新的形式（抗原漂移）。这些过程允许病毒改变其\"外观”，以至于它不再被我们的免疫系统识别，并使我们之前接触原始病毒的作用不大。甲型流感病毒就是最好的例子，该病毒因突变其表面蛋白（血凝素和神经氨酸酶）以逃避免疫识别而臭名昭著，导致猫捉老鼠的永恒游戏，需要在每个流感季节开发新的疫苗配方。< /p>

免疫反应无效的第二个原因有点复杂，往往是由于初次感染后宿主免疫系统中记忆细胞水平下降所致。然而，短暂免疫的原因尚不完全清楚，很大程度上取决于所讨论的病毒以及无数的流感病毒因素，如遗传、年龄和以前接触过病原体。一个非常相关的例子是地方性冠状病毒，例如 OC43-CoV 和 229E-CoV，它们的感染可能只会导致几个月的免疫力。例如，90 年代初的一项研究表明，在初次接触 229E-CoV 仅一年后，大多数患者就会再次感染，并与抗体滴度下降相关 [1]。免疫记忆力下降的原因尚不完全清楚，但通常归因于此类病毒的轻微致病性首先会引发一些乏味的免疫反应。

鉴于某些冠状病毒的免疫力短暂, COVID-19免疫一直是热门话题。大多数患者表现出非常有效和持久的抗体反应，而有些患者在感染后几乎没有可检测到的抗体 [2]。虽然我们还不确定这是一种免疫现象还是检测不敏感的问题，但还需要一些时间距离我们能够真正了解我们的身体对这种疾病的反应还有很长时间。

血清学检测在临床诊断中非常重要。在进行血清学检测以确定一个人是否患有疾病时，具体检测的是什么以及通常如何实现？

根据定义，血清学是对血清及其成分的科学检查。然而，在传染病的临床诊断的背景下，它通常是指使用测量抗原或抗体的免疫测定法。免疫测定有多种形式，但最好的例子是酶联免疫吸附测定 (ELISA)，它使用塑料滴定板结合患者样本中的抗原或抗体并产生可检测信号。

四种可供选择的 ELISA 格式：1) μ -IgM capture assay: 患者血清中的IgM抗体与充分结合的抗人IgM结合，一旦结合，Spike和检测抗体结合； 2) Blockade of binding assay: 在没有患者抗体血清的情况下，特异性单克隆抗体结合良好-bound Spike 并产生信号。在患者抗体血清存在的情况下，患者抗体结合良好结合的 Spike 并排除检测 a抗体，导致阴性信号；使用的单克隆抗体结合高度特异性的刺突表位，因此仅被 CoV 特异性患者血清阻断，而不会被交叉反应的 CoV 血清阻断； 3）双抗原桥接试验：患者血清抗体与结合良好的Spike结合，然后进行标记检测Spike；这种形式固有地检测具有更高特异性的更高亲和力的抗体； 4) 淬灭试验：非特异性 CoV 患者血清抗体能够结合交叉反应性刺突表位，导致假阳性结果。为防止这种情况，在溶液中加入过量的 Spike 以淬灭交叉反应抗体。这仅允许 CoV 特异性抗体产生真正的阳性信号。

第二种主要的免疫测定形式是侧向流动测定 (LFA)，它使用吸收垫吸收和分析并通过一系列特异性抗体产生可检测信号。这些化验具有价格低廉和便携的优点，通常可以 pr在几分钟内获得结果。

横向流动分析的基本设计，类似于家庭妊娠试验。 LFAs通常包括一个塑料盒，其中包含一条能够吸收和运输分析物的纸条。 1) 首先将血液或痰液中的分析物添加到纸条的一端，在那里它被纸吸收，使病毒抗原沿着它迁移。 2) 这些抗原首先遇到结合抗体的区域，结合抗体与可检测标签一起粘附在它们上面。 3) 然后抗原迁移到对病毒具有高度特异性的测试抗体区域，并结合产生一条可见的实线，表明阳性结果，从而确认感染。然后可以使用二级控制线检测偶联抗体并确保测试正常进行。

新兴研究表明，SARS-CoV-2 的血清学非常复杂，与其他 β 冠状病毒有显着差异。对 SARS-CoV-2 的抗体反应似乎发生得较晚，并且滴度低于通常观察到的病毒感染，影响了 way 其中化验设计用于诊断急性和历史感染。另一个重要的考虑因素是抗体可能与其他共同传播的冠状病毒发生交叉反应，需要密切注意所用抗原的结合特异性。

在当前的 COVID-19 大流行中，血清学检测对于发现了很多关于这种疾病的信息——我们希望从中学到什么？

自大流行开始以来，逆转录酶聚合酶链反应 (RT-PCR) 一直是诊断活性物质的主要手段感染。然而，由于分子方法依赖于病毒核酸的存在，因此当病毒存在于呼吸道时，它们在感染的急性期仅限于一个狭窄的窗口。这在检测先前病例和了解这种疾病的传播动态的能力方面存在重大差距。另一方面，SARS-CoV-2 抗体在感染后可能会持续一段时间w 待患者康复后进行回顾性诊断。由于多种原因，这特别有用。

首先，随着政府放松封锁，高质量的流行病学数据对于关注时间和地理疾病动态至关重要，这将需要对人群中的抗体进行频繁采样（血清调查).在护理点 (PoC) 使用血清学检测进行诊断也有明显的优势。与高通量 RT-PCR 或 ELISA 免疫测定不同，LFA 为急性期诊断提供了一种高度实用和快速的替代方法，对于识别无症状携带者和感染者以确保他们与普通人群隔离至关重要。

< p>血清学的另一个主要作用是在疫苗测试中。到目前为止，目前有超过 130 种候选疫苗正在筹备中 [3]。虽然这些疫苗基于广泛的平台，（包括 mRNA、DNA、纳米颗粒、亚基、合成肽和病毒样颗粒s，仅举几例），几乎可以肯定地说，SARS-CoV-2 疫苗将引发对刺突蛋白的免疫反应。然而，考虑到疫苗诱导的抗刺突 IgG 水平可能与自然感染产生的水平无法区分，因此需要替代抗原来设计疫苗特异性检测。这些测定法对于评估疫苗诱导的抗体依赖性增强 (ADE) 的潜在风险也非常有用，其中当患者感染真正的 SARS-CoV-2 时，疫苗产生的抗体能够促进更具侵略性的发病机制

您如何为 SARS-CoV-2 等新病原体的血清学检测准备试剂？为什么这些试剂\"天然”很重要？

在开发任何免疫测定时，最重要的组成部分是用于设计它的抗原和抗体。选择这些试剂的考虑范围很广：抗原应包括最合适的表位有助于提高灵敏度，应测试抗体对相关抗原的高亲和力。在考虑特异性时，确保检测抗体不与交叉反应表位结合至关重要，这些表位通常存在于病毒抗原的更保守区域。

要调节检测的灵敏度和特异性，也可以使用蛋白质的特定部分。就 SARS-CoV-2 而言，研究人员正在研究其刺突蛋白的各个不同区域，以用于免疫测定。 Spike 的 S1 和 S2 亚基是免疫测定开发的热门选择，因为它们高度暴露于病毒的外部环境，并且很容易诱导有效的抗体反应。特别是，结合 S1 的 RBD 的刺突抗体可能能够通过阻止与 ACE2 的结合来中和病毒。刺突受体结合域 (RBD) 通过结合人 ACE2 来介导细胞表面附着和内化受体。鉴于 RBD 在宿主细胞进入中的作用，它能够引发高度中和的抗体反应，并且是疫苗开发的热门目标。 RBD 还显示出其他冠状病毒刺突蛋白之间的高度序列差异，使其成为开发敏感和特异性免疫测定的流行抗原。 SARS-CoV-2 刺突蛋白的 N 端结构域在整个冠状病毒家族中显示出最高的序列变异性，使其成为一种流行的抗原选择，可最大限度地提高诊断检测的特异性。

RBD 和整个 Spike 的晶体结构，包括 B - 细胞线性表位图（右）。表位取自 Ahmed 及其同事和 Grifoni 及其同事的早期同源性建模和生物信息学研究。

鉴于处理活病毒的生物安全意义，从其他生物表达的重组抗原是开发检测的首选。然而，并不是所有的表达系统都是生来平等的。像大肠杆菌这样的简单生物很容易进行基因操作，但缺乏必要的翻译后机制来糖基化蛋白质。据统计，每个 SARS-CoV-2 刺突三聚体包含多达 66 个聚糖（见上图），以促进折叠和介导病毒向性等。从分析开发的角度来看，这些聚糖构成了许多被检测抗体识别的关键表面表位，使用未糖基化的刺突有结合非特异性、交叉反应抗体的风险，这会降低诊断特异性。

为确保生成具有完整糖基化模式的刺突并正确折叠，需要使用更复杂的系统。在 The Native Antigen Company，我们使用我们的 VirtuE 哺乳动物 (HEK293) 系统，该系统专为表达具有正确折叠和完全糖基化的高质量抗原而开发。

您对 The Native 的未来有何看法Native Antigen Company 及其与 OXGENE 的合作？

SARS-CoV-2 基因组在 1 月初发布后，是一场全力以赴的开发和发布 re代理商。经过我们研发团队的巨大努力，我们在 2 月初成功生产出第一批 S1 抗原，并开始向全球客户发货。然而，下一个挑战是制造能力。鉴于 IVD 和疫苗行业的需求，我们很快就开始努力满足如此庞大的需求。幸运的是，我们能够联系到一些可以支持我们进行规模生产的制造商。

我们的第一个合作伙伴 OXGENE™ 一直在使用他们的 Protein Machine Technology 开发用于生产刺突抗原的稳定细胞系.他们的技术使用专有的腺病毒载体将 SARS-CoV-2 DNA 携带到人体细胞中，然后将其输送到细胞核以稳定整合。从这里开始，细胞系可以大量培养以产生大量蛋白质，而没有瞬时表达产量的固有限制。优化表达的工作仍在进行中，但我们希望获得一些积极的数据

参考文献

1) Callow, KA., Parry, HF., Sergeant, M., Tyrrell, DA. （1990）。人类对实验性冠状病毒感染的免疫反应的时间过程。 Epidemio Infectl 105(2)； 425-446

2) 对 SARS-CoV-2 的免疫反应和免疫力 [互联网]。欧洲疾病预防控制中心，2020 年，6 月 19 日（https://www.ecdc.europa.eu/en/covid-19/latest-evidence/immune-responses）。

3) 草图COVID-19 候选疫苗[互联网]。世界卫生组织 2020 年，6 月 18 日（https://www.who.int/publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines）。

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